核开关是一类保守的非编码RNA分子。本项目通过对新型辅酶类核开关——NAD＋核开关多维度的结构探索，阐释了RNA分子对NAD＋特异性识别机制并建立了新型阶梯式响应的核开关调控模型。

Riboswitches are conserved non-coding RNA domains located in the 5’-end of mRNA, which can specifically regulate the down-stream gene-expression by interacting with metabolites in a protein-independent way. In this project, we focused on the research of the recently identified NAD+ riboswitch that can specifically recognize the key co-factor NAD+. Based on multiple dimensional structural investigations, we illustrated the specific recognition mechanisms of NAD+ riboswitch and established novel NAD+-related gene-expression regulation model.

项目负责人任艾明博士，2010年在中科院上海有机所获得博士学位，随后在美国斯隆凯瑟琳癌症研究中心Dinshaw Patel教授课题组进行博士后研究。2016年入职浙江大学生命科学研究院任研究员，同年获得国家人才引进计划的支持；随后作为独立研究员，带领团队针对能够独立发挥功能的重要RNA分子高级结构和作用机制进行研究，2020年获得了国家自然科学基金委优秀青年项目的支持。

项目研究团队目前主要由浙江大学的在读博士研究生组成，研究成果也主要由博士研究生完成。团队先后在国际著名学术期刊如Nature Chemical Biology，Nature Communications, PNAS及Nucleic Acids Research等发表以浙江大学为第一单位的高水平论文7篇。本项目虽然为国际合作项目，但主要由项目研究团队主导和完成，对方团队进行补充和协作。

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图1 核开关组成与作用模型示意图

图2 NAD与NAD核开关

图3 NAD+核开关复合物结构

(A) NAD+核开关Domain1 结合NAD+的复合物结构； (B) NAD+核开关Domain2 结合NAD+的复合物结构。

图4 NAD+核开关的调控模型

众所周知，生命活动主要依靠基因编码的蛋白质而运转的。那么貌似冗余的非编码RNA分子如何参与生命活动，RNA分子机器如何组装、如何运转，能否也像蛋白一样独当一面，执行基本的生物学功能呢？项目中研究的NAD+核开关展示了貌似无序的非编码RNA分子如何以优美的身姿独立而准确得操控蛋白表达的开和关。

核开关是2002年被首次鉴定出来的mRNA分子5’端非编码区的一段保守序列。一般含有两个结构域——识别模块（sensor domain）和表达平台（expression platform）。识别模块像探测器一样能够识别特定的配体小分子或相关代谢物，一旦与配体结合，整个核开关分子会立刻变身进而改变表达平台RNA的构象，从而在转录阶段（RNA水平）或翻译阶段（蛋白水平）控制下游基因的表达（图1）。目前已经发现的核开关约40种，主要分为嘌呤及其衍生物类核开关、蛋白的辅酶化合物类核开关、氨基酸类核开关、阴离子核开关、金属离子核开关以及Glms（glucosamine-6-phosphate, GlcN6p）核开关。NAD+核开关特异性得识别辅酶NAD+，是最重要的一类辅酶类核开关。

NAD+( Nicotinamide Adenine Dinucleotide)即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (图2A)，因为良好的电子转移特性，作为辅酶因子参与细胞内很多重要的氧化还原反应，是生命机器能够顺利运转的关键润滑剂。虽然NAD＋早已广为人知，但直到2019年，识别NAD+的核开关才被首次鉴定出来，主要负责调控与NAD+合成相关的蛋白的表达。然而NAD+核开关与其他已有核开关不同的是，它含有两个结构类似的配体探测器（识别结构域Domain1和Domain2），但实验却发现它们对NAD+的亲和力完全不同（图2B）。

为了阐明NAD+如何被核开关两个探测器分别识别？两个探测器又是如何互作参与核开关对NAD+的调控？我们利用X-射线晶体学的方法，分别解析了Domain1和Domain2结合NAD+复合物的高级结构,首次获得了特异性识别NAD+的RNA分子三维空间结构以及由RNA分子组成的特异性识别口袋（图3）。随后，通过高级结构信息的比对， 我们发现Domain1中特有的远程配对作用像订书钉一样将domain1的结合态固定住，而这是导致两个结构域对NAD+亲和力差异的主要因素。进一步结合突变和动力学检测结果，我们构建了含有两个串联结构探测器的NAD+核开关对不同浓度NAD+阶梯式响应的模型（图4）。当细胞内NAD+浓度开始升高时，只有domain1结合NAD+，传递抑制信号进行预警；一旦细胞内NAD+浓度超过预定值，domain2会迅速结合NAD+，启动核开关结构改变，使得表达平台的SD序列被固定、核糖体无法靠近，从而抑制后续蛋白表达。

我们的研究完美得阐释了NAD+核开关三维折叠规律和基因表达调控机制；也进一步揭示单独的RNA分子也可以独当一面，作为独立的RNA分子机器参与最基本的生命活动 。